透射电子显微镜最新技术发展
发布时间:2017年06月01日

编者的话:台湾洪英杰等主要针对透射电子显微镜发展、应用领域做介绍,并对国际间TEM最新电镜发展如球差校正器、色差校正器、液态样品实验与时间解析TEM等新技术做一浏览,希望对国内透射电子显微镜的进一步研发有帮助

 

透射电子显微镜最新技术发展

洪英杰、郭育秀

捷东公司 应用工程部

一、前言

人类对于微观事物的研究一直存在着高度的好奇心,期望能看到最小(高解析)、最清楚(高对比度)、最真实与最丰富的讯息。然而人眼裸视的解析度大约只能到10-4m,使得观察解析度受到很大的限制。1590年荷兰的眼镜制造商Zacharias Janssen以凸透镜跟凹透镜组合成圆柱状,可以将物体放大3-9倍、这应该是目前可考证最早的复式光学显微镜,经过四百多年的演进、解析度到达了约0.2μm的等级,但也不容易再提升上去了,主要原因是解像力大约是波长的一半,而可见光的平均波长约在0.55μm,因此其解析度的门坎也落在0.2μm左右了。因此寻求更短波长的光源成为解析度能否突破的关键,然而这个光源的特性也必须能够让仪器可以随心所欲的偏折才能达到实用的目的。1926年德国物理学家Hans Busch发现电子可以利用电磁线圈来偏折就如同光线可以经由透镜偏折一样,在建立了电子光学的理论基础后,1928年匈牙利的物理学家Szilárd Leó说服了Hans Busch开始落实电子显微镜的建构,1931年的4月7日德国柏林工业大学的Max Knoll与当时的博士班学生Ernst Ruska成功发展出全球首部透射电子显微镜(Transmission electron microscopy, TEM)之后,观察的解析度由μm等级提升到nm等级,人类的微观研究之路又迈进了一大步。

历经85年的发展,TEM逐渐成为许多科学技术仰赖的重要工具,为求能进一步拓展应用范围,近年有几个重要突破的课题,分述如下:

1.解析度的提升:电子显微镜的理论解析极限在哪里呢?能否看到周期表中最小的氢原子呢?根据解析度的法则,若把电子加速到100Kev,其波长约为3.7pm(pm为10-12m),远比氢原子的尺寸100pm要小得多,按道理说应该可以轻易地看到氢原子,然而事实上却是相当困难,主要是电子带负电荷,具有先天的库伦斥力,且电子容易受到外来环境干扰(如电磁波),加上电磁线圈本身存在成像的像差,使得理论解析度与实际有很大落差。电镜中具有三个主要像差,分别是球面像差(Spherical Aberration)、色散像差(Chromatic aberration)以及散光像差(Astgmatism),其中散光像差是操作者可以调整的,然而球面像差、色散像差在一般传统TEM中却无法调整,近年球差校正器与色差校正器的发展突破了瓶颈,将解析之路迈向sub Å等级。

2.液态样品的观察:电子在空气中容易受空气干扰而衰减,因此必须在真空下操作以确保品质,然而真空也同时限制了样品观察的种类,诸如含水性的高分子与生物样品都必须经过特别的处理才能进入TEM,但是过多的处理往往会伴随人工添加讯息的不真实讯息,然而科技一日千里,目前在已有许多解决方案,甚至可以达到In-situ临场实验的等级。

3.超高速临场实验:对于某材料反应机制的研究,由于过程相当快速,因此需要一个能高速拍照的TEM,这类TEM称为UEM(Ultrafast TEM) 或DTEM(Dynamic TEM),拥有ns至fs的时间解析能力,是临场实验中的超级跑车。

二、球面像差校正器的进展:

球面像差的现象解释,当球差未修正时,在光轴外围的光束会比接近轴心的光束偏折更多,无法聚在同一个对焦面而形成球面像差。对于光学镜片而言,早在1620年法国哲学及物理学家笛卡儿即有球差修正的设计,现代许多高阶镜片也普遍将镜片外围变薄以降低折射率来修正。

1936年正当TEM的发明团队为提升解析度而伤透脑筋时,另一位电子光学专家Otto Scherzer丢出震撼弹,他的结论是即使最佳的旋转对称电磁透镜永远都无法解决色差与球差的问题,该论文被称为"Scherzer 定理",似乎告诉我们TEM过不了这两个先天的门坎。在实务操作上,我们可以利用提高电压或缩小孔径的方法来降低球差,然而这两者分别有破坏样品的风险与亮度降低的缺点,往后的数十年许多科学家的努力均仅止于修改polepiece形状,降低polepiece gap尺寸甚至寻求更完美的材料等改善方案,但却无法彻底修正球差,然而另一批科学家却致力于寻找Scherzer论述的漏洞并提出解决方案,1995年德国EMBL(European Molecular Biology Laboratory)科学家Rose与Max Haider带领的团队成功利用六极校正器得到TEM mode的球差修正结果,并于1998年在商用高阶TEM上测试成功,另一方面英国Cavendish Laboratory的科学家O ndrej Krivanek也发展出4极-8极的STEM mode球差校正器,这两个球差校正器的出现让微观尺度的观察迈入sub Å(10-10m)时代。在TEM的高解析结晶物质影像中,TEM mode可以得到晶格像,它的成像是由晶格绕射电子束再互相干涉所形成,属于投影式;而STEM mode则可以得到原子结构像,是微小电子束对晶体扫描而来,属于扫描式。其中晶格像可以看到周期性变化,但对单原子的缺陷因属于非周期性,则需原子结构像才能看到。

迭经近二十年的演进,球差校正器也做了许多修正,例如装配在JEOL 300KV冷场TEM上的非对称型球差校正器,该非对称设计有利于修正高次元的球面像差,利用该仪器在STEM mode以高角度环形暗场侦测器(High Angle Annular Dark Field Detector, HAADF),侦测器所观察的Ge晶体[114]原子列的原子结构像,该间距只有47pm(亦即0.47Å),而若未搭载球差校正器,其影像解析度约在1.7Å,空间解析度则约在4Å左右。

读者或许好奇47pm的宽度已经远小于氢原子直径100pm了,应该很容易看到氢原子了吧?在此还有一个环节需解决,就是讯号对比的问题,由于重元素散射角度较大,可用HAADF轻易观察到,而轻元素散射角度小,与穿透电子束接近,而讯号量又比穿透电子束暗得多,因此并不易解析出来。目前科学家发展出环形明场像(Annular bright field, ABF)技术,将穿透电子束极中央的位置用圆形beam stopper挡住,只让外围露出环状讯息,如此即取得了超低角度的STEM环形影像,如此低的角度除了取得轻元素影像也同时降低了重元素讯号比例,对轻元素观察相当有帮助。在2011年东京大学的Ryo Ishikawa发表氢原子的ABF成果,至此周期表最小元素的观察已经挑战成功。Yttrium–Hydrogen的ABF与原子位置叠合图,氢原子清晰可见,而在传统的BF与HAADF中则因对比或散射角度问题无法看到氢原子。

三、色散像差校正器的进展

色散像差则是另一个需要解决的问题,由于光源能量不同造成聚焦点不同而产生色差,色差对解析度与对比度都有一定影响,在光学中可以利用多种镜片组合来消除色差,然而TEM中需作另外的设计。

在电子显微镜的色差校正器(Monochromator)通常采用Wien filter来滤除能量不同的光源,该filter是德国物理学家Wilhelm Wien于1898年所设计,由于电子速度跟电场与磁场的组合有关,在filter内设计一组电场与另一组垂直的磁场,则当电磁场值固定时,只有某种速度的电子能平行通过filter,基本上是属于带电粒子的速度筛选器。在TEM的色差校正器中通常设计两组Wien filter,其中第一组形成的色差可由第二组修正回来,在如此的色差修正后,能量分散度可以达到25meV,而未修正前Schottky Thermal FEG为0.8eV左右,Cold FEG则在0.3eV左右,因此这对影像而言也将是相当大的突破。色差修正另一重大影响是光谱解析度,例如电子能量损失光谱仪(EELS),在某些应用中可以判别键结种类,其能量差异有时仅有不到1eV,在修正后将有助于精确分析材料键结甚至高分子与生物样品的EFTEM观察或EELS mapping。

在解决了球差与色差两个大难题之后,就可以把两种校正器结合在一起了,在解析度整体提升后,背后代表另一个意义是可以在低电压下利用像差修正得到比以前更好的解析度,如此一来,许多容易beam damage的样品,如graphene或生物样品在30KV左右的SEM工作电压操作也就不足为奇了!

四、液态样品的观察

过去高含水量或液态样品在TEM中被视为无法直接观察,因为真空会吸干水份让样品失去原貌,所以会使用染色、化学固定、冰封等方法来处理样品,但这些都不是样品原貌。如果需要将液态样品放入电镜,需顾及真空不能被破坏,因此必须要有材料可以包覆样品,而这包覆材料必须不能过度干扰观察,亦即电子穿透率要高,且不能太厚,最后它的韧性需足够,要承受得起样品跟真空的压力差,其中发现氮化硅是相当不错的材料。

目前公认比较成熟的作法是以Liquid cell方式将液态样品包覆其中,其组成包含外盖、大上盖与小下盖,在上下盖间用O-ring封住液态样品,其外盖设计为了EDS元素分析,也在中央区作薄化处理,其中水蓝色部分为液体分布区。

此外,由于TEM holder可以取出至其光学显微镜观察,因此也有生物研究者搭配荧光显微镜与TEM结果作比对,如此可同时得到荧光标定的官能基讯息与TEM的高解析影像。若搭配电极甚至可以进行电化学分析,该实验模拟锂电池在电解液中来回充放电所造成的电性与电极劣化现象,现今发展已经不是纯粹液态样品观察,而是推向临场实验的等级了。

五、超高速电子显微镜的发展

人类对未知世界探索的欲望无穷无尽,在影像品质与样品处理这两大难关克服之后,仍有一个难题需要克服,那就是时间。我们渴望能亲眼看到许多事情发生的经过,因此发展了临场实验观察技术,然而许多的反应比我想象快得多,例如纳米颗粒往往可以在ns或ps时间内完成一个可逆的相变化,以一般的TEM camera的感度在ms左右讯杂比已经很差了,ns对它来说是严重曝光不足,根本无法拍照。为解决此问题,加大电流或许是个方案,一般TEM大约在pA至nA等级电流成像,而根据比例估计,ns的拍照速度必须提高到mA等级以上才够用,但这么大的电流作连续发射会烧毁灯丝,因此科学家设计了时间解析型TEM(time-resolved TEM),或称为超高速电子显微镜(UEM),其运作方式,是以类似高速闪灯的方式作高速曝光,其频闪速度约ns至ps,甚至未来目标是fs,以便能解析更快速地变化。在如此高频的电子束中,事实上需依赖镭射来作频闪激发,然而在激发后产生电子源并到达样品还有一段时间差,为了能精准控制光源确实抓到反应程序的正确时间,必须再搭配另一支镭射来触发样品反应,并作适当的调频确认。

装设在JEOL TEM上的UEM系统,超高速电子显微镜已经陆续被应用在材料与生物的反应机构探讨,例如光触媒反应、纳米相变化或动力学、冷冻电镜的蛋白质结构相变化探讨等等。若以反应的机制来分,可逆的机制可用连续脉冲来观察,仪器称为UEM,但若反应为不可逆,则只能做一趟多次脉冲观察,仪器称为DTEM, DTEM的拍照机制也很特别,因为Camera不能有如此高速快门,因此通常把多次脉冲所得到的影像曝光在不同的Camera位置,以达到高速取像的要求。UEM与DTEM由于具备时间轴的概念,其发展已将人类的微观领域带入四度空间。

六、结论

透射电子显微镜的发展日新月异,许多过去认为无法做到的实验在许多科学家的努力下已经一一做到了!而这些努力的初衷,是追求更微观、更真实、更明确的科学证据,达到真善美的一个境界,探讨未来的世界,故事未了!

相关文献

[1] K.Takayanagi, et al.. JEOLnews Vol. 45, Number 1, (2010), 2-7

[2] Ryo Ishikawa et al. Natual Materials, Vol 10, APRIL (2011)

[3] Mukai M. et al. Design of a monochromator for aberration-corrected low-voltage (S)TEM, Poster IT-1-P-2578 18TH IMC (2014)

[4] Peckys et al. Biophysical Journal vol.100, No.10 (2011) 2522.

[5] Protochip Poseidon 510 TM Application note

[6] 4th Physical Institute-Roper group website

[7] IDES, Intergrate Dynamic Electron Solution website